CIPEX-System

Der Ciliaten-Vorteil f√ľr Biopharmazeutika

Das Ciliaten basierte Expressionssystem (CIPEX-System):

Machbarkeits- und Evaluierungsstudien demonstrieren die breite Anwendbarkeit des Ciliaten basierten Expressionssystems.

Das von der Cilian AG entwickelte CIPEX-System ist eine innovative Expressionsplattform zur effizienten Produktion von Protein-basierten Biopharmazeutika. Es basiert auf dem apathogenen eukaryotischen Einzeller Tetrahymena als Produktionsorganismus, welcher in idealer Weise die Vorteile von Wirtsorganismen herkömmlicher Expressionsplattformen verbindet.
Die hohe biologische Sicherheit, das preisg√ľnstige und effiziente Fermentationsverfahren sowie die M√∂glichkeit, glykosylierte Proteine zu synthetisieren, machen das CIPEX-System zur idealen L√∂sung f√ľr die Produktion komplexer rekombinanter Proteine. Eine Ausschleusung der rekombinanten Proteine in das Kulturmedium vereinfacht zus√§tzlich die Aufreinigung des Produkts erheblich.
Die Cilian AG konnte, im Rahmen von Evaluierungs- und Machbarkeitsstudien mit industriellen Partnern und in internen Projekten, durch die heterologe Expression von insgesamt 14 pharmazeutisch relevanten Proteinen, die Funktionalität der Plattformtechnologie CIPEX unter Beweis stellen.

Die Studien wurden sowohl f√ľr sekretierte als auch f√ľr membranst√§ndige oder intrazellul√§r lokalisierte Proteine durchgef√ľhrt. Hierbei wurden Proteinausbeuten erzielt, welche mit denen am Markt befindlicher Expressionssysteme mindestens vergleichbar sind.
Neben genetischen und analytischen Methoden wurden verschiedene up- und downstream– Verfahren entwickelt und erfolgreich an die Anforderungen der Zielproteine angepasst.

Das F&E-Team der Cilian AG verf√ľgt daher √ľber eine au√üerordentlich breite Wissensbasis auf dem Gebiet der rekombinanten Proteinproduktion mit Ciliaten. Die Fachkompetenz unseres F&E-Teams erm√∂glicht einen scale up bis hin zum industriellen Produktionsma√üstab.

Wir bieten Ihnen die Prozessentwicklung und die rekombinante Herstellung von komplexen Zielproteinen, wie z. B. viralen Antigenen oder monoklonalen Antik√∂rpern, mit der innovativen CIPEX-Technologie an. Unser Leistungsangebot finden Sie unter ‚äāService‚äÉ.

 

Vorteile des CIPEX-Systems:

Effiziente Produktion komplexer Proteine

Das CIPEX-System ist ein eukaryotisches Expressionssystem, das eine mit h√∂heren tierischen Organismen vergleichbare Proteinbiosynthese bietet. Rekombinante Proteine werden posttranslational modifiziert und prozessiert. Dies schlie√üt u. a. die Bildung von Disulfidbr√ľcken, GPI-Ankern und N-Glykanen ein.

Die Proteinmodifikation ist eine wesentliche Voraussetzung f√ľr die korrekte Faltung und somit auch f√ľr die Funktionalit√§t komplexer Biopharmazeutika.

Sekretion von Zielproteinen

Tetrahymena sekretiert Proteine effizient in den Fermentations√ľberstand. Dies macht die Aufreinigung eines Zielproteins mit dem CIPEX-System kosteng√ľnstig und einfach.
Zur Ausschleusung eines rekombinanten Proteins kann die Cilian AG Zielsteuerungssequenzen bereitstellen, es können jedoch auch die zielproteineigenen Signalpeptide genutzt werden.

Konsistente Glykosylierungsstruktur

Unser Produktionsorganismus synthetisiert Proteine mit einer hochkonsistenten biantennaren Oligomannose-N-Glykosylierungsstruktur. Eine gleichmäßige Glykosylierung ist gerade im Fall von Biopharmazeutika ein entscheidendes Qualitätsmerkmal.
Dies trifft im besonderen Ma√üe auf therapeutisch wirksame monoklonale Antik√∂rper zu. Hier f√ľhrt eine gleichm√§√üige Glykosylierung zu einer einheitlichen Stabilit√§t der Antik√∂rper in der Blutbahn, minimiert das Nebenwirkungsrisiko und macht einen gut kontrollierbaren Therapieeffekt sehr wahrscheinlich.

Hohe Produktivität

Die Raum-Zeit-Ausbeute spielt eine entscheidende Rolle f√ľr die rekombinante Proteinproduktion. Bei Machbarkeitsstudien wurden f√ľr pharmazeutisch relevante Proteine mit dem CIPEX-System Raum-Zeit-Ausbeuten erreicht, welche mit denen herk√∂mmlicher Expressionssysteme vergleichbar sind.
Bereits ohne die Verwendung von aufwendigen clone screening Ans√§tzen, wurden in Tetrahymena f√ľr monoklonale Antik√∂rper Raum-Zeit-Ausbeuten von 10 mg/L und Tag, f√ľr Impfstoff-Proteine sogar Raum-Zeit-Ausbeuten von 60 mg/L und Tag erreicht.

Verfahrenstechnische Vorteile

Tetrahymena kann mittels gut etablierter Fermenationstechniken (Batch, Fed-Batch und kontinuierliche Fermentation) zu hohen Zelldichten (bis zu 2 x 107 Zellen/ml) kultiviert werden. √Ąhnlich den Hefen, zeichnet sich unser Produktionsorganismus hierbei durch ein schnelles Wachstum mit Generationszeiten von 1,5 h – 4 h aus.

Die Proteinproduktion erfolgt in herk√∂mmlichen Produktionsanlagen f√ľr mikrobielle Expressionssysteme (Bakterien oder Hefen), so dass keine kostenaufwendigen Ver√§nderungen an bestehenden Produktionsanlagen oder ein Neubau von Produktionsanlagen notwendig sind. Eine Ma√üstabsvergr√∂√üerung bis in den 1000 L Ma√üstab konnte bereits problemlos demonstriert werden.

Tetrahymena zeichnet sich durch schnelles Wachstum auf kosteng√ľnstigen peptonhaltigen Medien und auf chemisch definierten Medien ohne Peptid- oder Serumkomponenten aus. Die station√§re Wachstumsphase wird bereits nach einer Kultivierung von 30 h erreicht. Da im Gegensatz zu menschlichen und tierischen Zellkulturen keine Zus√§tze (Peptide oder Serum) erforderlich sind, erwartet man Medienpreise, die eine Gr√∂√üenordnung unter denen f√ľr menschliche oder tierische Zellkulturen liegen.

Hohe biologische Sicherheit

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die biologische Sicherheit von Tetrahymena. Prinzipiell gelten Ciliaten als unbedenklich, da sich Viren aus h√∂heren Organismen auf Grund der au√üergew√∂hnlichen codon-usage und des hohen AT-Gehalts des Genoms nicht in Ciliaten vermehren k√∂nnen. Hinzu kommt, dass Ciliaten der Gattung Tetrahymena exzellent untersuchte Modellorganismismen sind, bei denen in √ľber 50 Jahren Grundlagenforschung keine Viren beobachtet wurden. Zudem konnten in Tetrahymena-St√§mmen in Zusammenarbeit mit unabh√§ngigen Labors und unter Verwendung von erprobten Indikatorzelllinien keine relevanten endogenen Erreger wie Viren und Mykoplasmen, die menschliche oder tierische Zelllinien infizieren, nachgewiesen werden. Damit kann in Produktionsprozessen, die auf Ciliaten der Gattung Tetrahymena basieren, eine Vermehrung von Viren, die bei h√∂her entwickelten Tieren oder dem Menschen vorkommen, mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden.

Kostenaufwendige Virus-Abreicherungsverfahren, wie sie bei industriellen Prozessen mit menschlichen und tierischen Zellkulturen notwendig sind, können damit eingespart werden.
Dies unterscheidet Tetrahymena drastisch von den herk√∂mmlich eingesetzten Mammalia-Zelllinien wie CHO, BHK, NSO oder menschlichen Zelllinien, die in der pharmazeutischen Produktion mit hohem technischem Aufwand vor der Kontamination mit Endoparasiten gesch√ľtzt werden m√ľssen.

Damit ist Tetrahymena als Produktionsorganismus f√ľr therapeutische Proteine der biologischen Sicherheit herk√∂mmlicher, tierischer, und menschlicher Zellkulturen deutlich √ľberlegen.

Etablierte molekularbiologische Werkzeuge

Optimierte, episomal replizierte high copy number Vektoren oder integrative Systeme stehen f√ľr die Proteinexpression mit dem CIPEX-System zur Verf√ľgung. High copy number Vektoren basieren auf den rDNA Minichromosomen von Tetrahymena, die in bis zu 9.000 Kopien pro Zelle vorliegen, was eine sehr hohe Gendosis und eine effiziente Proteinbiosynthese bzw. hohe Produktivit√§t erwarten l√§sst. Zudem kann durch die Wahl des Promotors, je nach Bedarf, die Proteinexpression konstitutiv oder induziert erfolgen. Weiterhin wird durch verschiedene Protein-Zielsteuerungssequenzen die effiziente Sekretion l√∂slicher Proteine in den Kultur√ľberstand erm√∂glicht.

Ein zus√§tzlicher, nat√ľrlicher Vorteil auf molekularbiologischer Ebene ist der AT-Reichtum des Genoms von Tetrahymena. So k√∂nnen Gene von Organismen mit AT-reichem Genom mit dem CIPEX-System ohne die Herstellung von synthetischen Genen direkt zur Expression gebracht werden (Beispiel: Plasmodium und andere Protozoen mit AT-reichem Genom).